劉加強^{1, 3},蔣圓圓^2*,楊楊陽¹,程海²,徐蕾²,劉強¹,陳天池¹

(1.徐州工程學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院,江蘇 徐州 221111；2.江蘇省徐州環(huán)境監(jiān)測中心,江蘇 徐州221000,

3.中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測繪學(xué)院,江蘇 徐州 221116）

摘  要：傳統(tǒng)塑料在環(huán)境中持久存在,嚴重威脅水生態(tài)安全和人體健康,對其毒性效應(yīng)進行評估受到全球廣泛關(guān)注.作為傳統(tǒng)塑料的替代品,生物可降解塑料的應(yīng)用越來越多,然而其對水生生物的生態(tài)風(fēng)險在很大程度上未知.為了進一步揭示生物可降解微塑料對水生生物的影響,以大型溞為模式生物,研究了聚乳酸（PLA）對其急慢性毒性效應(yīng).結(jié)果表明,PLA對大型溞的半數(shù)效應(yīng)濃度（48h-EC₅₀）為59.43 mg/L,95%置信區(qū)間為53.55-65.97mg/L.經(jīng)紫外照射處理的PLA毒性降低.PLA對大型溞游泳活力和攝食行為有濃度依賴性的抑制作用.與對照組相比,100mg/L的PLA顯著抑制了大型溞的心率和胸肢活動率,最大抑制率分別為31.4%和17.7%.21d長期暴露,10mg/L和40mg/L的PLA均一定程度上抑制了大型溞的生殖及內(nèi)稟增長率（r_m）,但其影響并不顯著.40mg/L的PLA顯著降低了大型溞的存活率,存活率僅為20%.PLA的暴露顯著誘導(dǎo)了超氧化歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的活性,表明大型溞受到氧化脅迫并引起脂質(zhì)過氧化損傷.PLA在濃度40mg/L時顯著抑制了乙酰膽堿酯酶的活性,從而引起大型溞神經(jīng)毒性和運動失調(diào).該結(jié)果對于綜合評判及預(yù)測生物可降解微塑料的生態(tài)風(fēng)險具有重要理論意義和實際價值.

關(guān)鍵詞：微塑料；聚乳酸；大型溞；毒性效應(yīng)

微塑料（MPs）在自然環(huán)境中普遍存在,由于其粒徑小、難降解,在環(huán)境可中存在數(shù)百至數(shù)千年,嚴重威脅水生態(tài)安全和人體健康,成為全球共同面對的一個新的問題和挑戰(zhàn).野外調(diào)研和室內(nèi)實驗研究表明,水環(huán)境中的MPs能被水生生物攝入^{[1, 2]}.攝入的微塑料會隨著食物鏈傳遞,而對不同營養(yǎng)級生物健康產(chǎn)生危害^{[3, 4]}.主要表現(xiàn)在生長抑制、組織損傷、氧化應(yīng)激、生殖毒性、神經(jīng)毒性和代謝紊亂等多種毒性效應(yīng).

傳統(tǒng)塑料（如聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）、聚氯乙烯（PVC）和聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）等）是穩(wěn)定的高分子聚合物,環(huán)境中難以降解.為了應(yīng)對傳統(tǒng)塑料對環(huán)境日益嚴重的污染,生物可降解塑料（如聚乳酸（PLA）、聚羥基丁酸脂（PHA）和聚丁二酸丁二酯（PBS）等）應(yīng)運而生,成為了傳統(tǒng)石油基塑料的替代品.生物可降解塑料進入環(huán)境后短期內(nèi)會產(chǎn)生大量微塑料,從而對水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響.有研究發(fā)現(xiàn),PLA較PET更容易被斑馬魚攝入,攝入的PLA會對斑馬魚造成腸道損傷,并引起腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的特異變化^[5].PVC和PLA都會對大型溞的生長、繁殖產(chǎn)生負面影響,PVC的影響主要歸因于材料中的添加劑,而PLA的影響是由顆粒本身引起的^[6].與傳統(tǒng)石油基MPs相比,生物基可降解MPs有著不同的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),同時其短期內(nèi)能夠產(chǎn)生顯著的變化,與其他共存污染物的相互作用與傳統(tǒng)塑料相比也不盡相同.在毒性效應(yīng)方面,生物基MPs對水生生物的影響與石油基MPs相比也必然有著顯著差異.生物基MPs可能與傳統(tǒng)MPs一樣有毒,然而目前生物基微塑料對水生生物的生態(tài)風(fēng)險仍在很大程度上未知,有待進一步研究.

為了揭示生物基MPs暴露對水生生物的毒理學(xué)效應(yīng),本實驗選取模式生物大型溞為受試生物,以使用最廣泛的生物基塑料PLA為研究對象,通過急性和慢性毒性實驗,探究PLA對大型溞生長發(fā)育,生殖,游泳和攝食等生態(tài)行為學(xué)指標(biāo)的影響,分析大型溞抗氧化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)酶活性的變化以及脂質(zhì)代謝系統(tǒng)的影響,以期為PLA污染的風(fēng)險預(yù)測和合理防控提供參考.

1  材料與方法

1.1  實驗材料和試劑

大型溞購自中國科學(xué)院水生生物研究所,其培養(yǎng)條件為溫度20±1oC,光暗比16h:8h,光照強度為1200lx.采用農(nóng)夫山泉天然礦物質(zhì)水作為培養(yǎng)液,每周更換2次,以小球藻為食物,每天一次,喂食密度為10⁵ cells/mL.350目的聚乳酸（P LA）購自中國淘寶.總蛋白（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所.

1.2  急性毒性實驗

參照OECD202標(biāo)準(zhǔn)方法進行急性毒性暴露試驗^[7].在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上設(shè)置6個暴露組（PLA濃度分別為10、20、40、80、100、200mg/L）和1個空白對照組（不添加PLA）,每個處理組3個平行.為確保PLA能夠均勻分散,暴露組實驗前需連續(xù)攪拌2h.為揭示紫外老化作用對PLA毒性的影響,相同設(shè)置條件下,暴露組實驗前需經(jīng)紫外燈（UVA-340,40W）照射處理24h（UV-PLA）.在實驗中,往100 mL燒杯中加入 50 mL培養(yǎng)液,隨機加入10只溞齡在6-24 h的健康幼溞,期間不投喂、不更換培養(yǎng)液.暴露24h、48h后分別記錄每個燒杯中幼溞的抑制率.

1.3 游泳活力測定

48h暴露結(jié)束后,取大型溞活體置于6孔培養(yǎng)皿中,每孔1只,逐個進行追蹤.每孔中暴露溶液 1.5 cm高,以保證生物只發(fā)生二維平面的位移.適應(yīng) 5 min后,使用數(shù)碼相機以每秒30幀的速度記錄下每只大型溞的運動軌跡,持續(xù)1min.然后使用圖像處理軟件Tracker^?5.1.5對視頻進行分析.設(shè)置比例尺和坐標(biāo)原點后,逐幀對大型溞的坐標(biāo)進行捕捉,繪制出大型溞的運動軌跡,并逐幀計算其平均速度v和加速度a.每個處理組取10只大型溞,其均值為該處理組的最終結(jié)果.

1.4 攝食率的測定

   根據(jù)Zhu^[8]等人的方法進行攝食試驗.48h暴露結(jié)束后,隨機挑選20只大型溞轉(zhuǎn)移到含有小球藻（初始密度約為1×10⁶ cells/mL）的暴露液中,黑暗條件下暴露5h.利用血球計數(shù)板計數(shù)的方法分別測定暴露前和暴露結(jié)束時小球藻密度,每個處理組重復(fù)3次.計算濾水濾（F）和攝食率（I）式中：C₀和C_t分別代表起始和終點小球藻的濃度（cell/mL）；t為暴露時間（h）；n為大型溞的個數(shù)；V為暴露液體積（mL）；C_t'為對照組終點小球藻濃度（cell/mL）；A為校正因子.

1.5 心跳速率和胸肢活動率測定

48h暴露結(jié)束后,用吸管將大型溞轉(zhuǎn)移至載玻片上,滴入適量暴露溶液.將載玻片置于配備CCD攝像機的光學(xué)顯微鏡下觀察,捕捉其心臟和胸支,生物適應(yīng)1min后,對其心跳和胸肢活動進行60s的錄像.然后使用計數(shù)器對錄像結(jié)果進行大型溞跳動次數(shù)的計數(shù), 每個視頻計數(shù)3次.每個處理組取 5只大型溞,其均值作為該處理組的最終結(jié)果.

1.6慢性毒性實驗

參考OECD211標(biāo)準(zhǔn)方法進行21d慢性毒性實驗^[9],根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果中48h-EC₅₀值,慢性毒性實驗設(shè)置了低、高兩個暴露組（PLA濃度為10mg/L和40mg/L）以及空白對照組（不添加PLA）.試驗在100mL燒杯中進行,每個燒杯放入1只健康幼溞（6～24 h）和50 mL培養(yǎng)液,每個處理組設(shè)置10個重復(fù),用于生殖實驗.另在盛有800 mL暴露溶液的1000 mL燒杯中隨機挑選200只健康幼溞（6～24 h）,用于抗氧化損傷實驗.在實驗期間,每天投喂小球藻（密度為10⁵ cells/mL）,每兩天更換一次培養(yǎng)液,并每天記錄大型溞的存活數(shù)、產(chǎn)溞數(shù),死亡數(shù),挑出新生幼溞,直到21 d結(jié)束.實驗結(jié)束后,統(tǒng)計首次產(chǎn)溞時間、首次產(chǎn)溞數(shù)、單雌產(chǎn)溞數(shù)和產(chǎn)胎數(shù)等數(shù)據(jù),并計算內(nèi)稟增長率r_m^[10].另外,21d暴露結(jié)束后,測定SOD、T-AOC、AChE和MDA等的活性,測試方法參考試劑盒中提供的進行.

1.7數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey's多重比較檢驗.數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,P<0.05表示存在顯著性差異.數(shù)據(jù)繪圖采用GraphPad Prism 5和Origin 2018實現(xiàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 聚乳酸（PLA）的特征

PLA的SEM圖像如圖1a和1b所示,整體大小不一、形狀極不規(guī)則；表面粗糙呈鱗片狀并伴有裂縫；經(jīng)紫外線老化處理的PLA(UV-PLA)如圖1c和1d所示,在形貌上并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化.在PLA濃度為200mg/L時,其粒度分布如圖2(a)所示,d(0.1),d(0.5)和d(0.9)分別為3.089,18.085和71.567um；對應(yīng)的UV-PLA粒度分布如圖2(b)所示,d(0.1),d(0.5)和d(0.9)分別為3.039,15.675和52.302um.粒徑的減小說明紫外老化作用加速了PLA的降解.大型溞是濾食性生物,Kokalj等人^[11]的研究表明,大型溞能夠攝食粒徑范圍0.7–70 um的微塑料.大型溞因誤食微塑料,產(chǎn)生錯誤的飽腹感,影響其生長發(fā)育,從而減少生物多樣性.

在2996、1757、1385和1088cm^-1處觀察到PLA的典型紅外吸收峰^[12],如圖2所示.在2996cm^-1處的吸收峰代表甲基C-H的伸縮振動^[13],1757cm^-1處的吸收峰與酯基C=O的伸縮振動有關(guān)^[14],1385cm^-1附近的吸收峰是由甲基C-H的彎曲振動引起的^[14],在1088cm^-1處觀察到非對稱橋接C-O-C的伸縮振動^[15],表明分子中存在環(huán)狀內(nèi)酯結(jié)構(gòu)^[16].此外,在1620cm^-1附近的吸收峰是由羰基C=O的伸縮振動引起的^[17],這可能是由于PLA中的添加劑引起的^[18].經(jīng)紫外老化處理的PLA（UV-PLA）相應(yīng)特征峰的強度明顯降低,進一步證實聚乳酸發(fā)生了降解.

不同濃度PLA暴露溶液中TOC濃度及釋放率如圖4所示,從圖4可見,總有機碳(TOC)濃度隨著PLA暴露溶液的濃度增加而增加.由圖4(a)所示,PLA濃度與TOC濃度之間存在顯著線性正相關(guān)（p<0.05）,相關(guān)關(guān)系R²為0.998；Belehradek方程能夠較好的描述PLA釋放TOC的過程,相關(guān)系數(shù)R²為0.945；由圖4(b)所示,對應(yīng)濃度下UV-PLA溶液TOC濃度均高于PLA,相應(yīng)增加了0.017~1.36倍.同樣的,UV-PLA濃度與TOC濃度之間為顯著線性正相關(guān)（p<0.05）,相關(guān)關(guān)系R²為0.993,TOC釋放率用Belehradek方程擬合的相關(guān)系數(shù)R²為0.996.聚乳酸浸出釋放的有機物質(zhì),可能影響到大型溞的毒性效應(yīng).

2.2  PLA暴露對大型溞活動抑制的影響

在暴露過程中,空白組大型溞未發(fā)現(xiàn)受到抑制的情況.PLA單獨暴露對大型溞的活動抑制率如圖5所示,結(jié)果表明,隨著暴露時間的增加,大型溞的活動抑制率也隨之增加.如圖5（a）所示,PLA對大型溞的活性抑制率呈濃度依賴性增加,當(dāng)濃度為200mg/L時,48h活動抑制率接近100%,表明高濃度PLA對水環(huán)境中大型溞的活動能力產(chǎn)生更不利影響.

根據(jù)劑量-效應(yīng)關(guān)系方程^[19]：Y=Bottom+(Top- Bottom) /(1+10^((LogEC₅₀-X)*HillSlope)),基于GraphPad Prism 5.0對數(shù)據(jù)進行擬合,直接得到劑量-效應(yīng)曲線和EC₅₀如圖5（b）所示.暴露24h和48h,劑量-效應(yīng)關(guān)系均成“S”型曲線.PLA對大型溞 24h和48h的 EC₅₀值分別為83.12和59.43 mg/L,95%的置信區(qū)間分別為70.43-98.09和53.55-65.97mg/L.Zimmermann^[6]等研究了不規(guī)則微塑料聚氯乙烯（PVC）,聚氨酯（PUR）,聚乳酸（PLA）和高嶺土暴露對大型溞21d的慢性毒性影響,發(fā)現(xiàn)所有類型微塑料（＜59um）都降低了大型溞后代的繁殖數(shù)量